如何正确诊断生殖器疱疹？

　　感染的诊断要依据病史、临床表现和实验室检查结果而定。有不洁性交史，而且在生殖器部位出现和原发性水疱，易复发等不难诊断。必要时可作疱液涂，培养、接种、荧光检查。血清免疫测定等，均有助于诊断和确定病毒类型。

　　一、细胞学方法

　　对皮损刮片做Wright-Gemsa (Tzanck试验)或Papanicolaou染色，可检出HSV感染特征的巨细胞包函体，但不能区别HSV感染或 — 病毒感染，敏感性仅为病毒分离的60%。

　　二、培养法

　　从水疱底部取材做组织培养分离病毒，为目前较敏感、最特异的检查方法，需5-10天，因其技术条件要求高，价格昂贵，不能普遍使用。

　　三、抗体检测

　　目前最广泛的是HSV-2抗体检测，如蛋白印迹法也可用gD2作抗原检测HSV-2抗体，具有敏感性，且能区分HSV-1和HSV-2的优点。

　　四、基因诊断

　　(一)用PCR分型检测单纯病毒

　　PCR是一种敏感性高，特异性强的快速检测方法，标本中含有1fg HSV-就可以检出，其在HSV感染的诊断研究中发展较快，且分型检测HSV是发展的趋势。

　　1、标本采集和处理

　　(1)标本采集

　　①脑脊液：直接无菌采取患者0.5ml脑脊液标本于无菌试管送检。如肉可见血色，应离心取上清。

　　②及婴儿血清： 同上，应避免溶血

　　③脑组织： 脑组织尸检、活检标本， 加1ml PBS标本研磨后，待检。

　　④眼及皮肤分泌物：用预测(半干)棉拭子直接取患处分泌物， 置1ml PBS标本缓冲液中送检。

　　⑤生殖器(宫颈、阴道、外阴、阴茎)标本：先用消毒棉拭子擦去病变部位表面粘液、污垢，再用预潮棉拭子用力擦拭患处分泌物，置1ml PBS标本缓冲液中送检。

　　(2)标本处理

　　①预处理：所有液体标本均可直接进模板制备;可以取100μl标本液，离心5000 r/ min×5min后，去上清，取沉淀物进行模板制备。

　　②模板制备：a: 蛋白酶K消化裂解法：沉淀物加100μl蛋白酶K消化裂解液，55℃1 h后，煮沸10 min，离心5000 r/ min×5min，收集上清。 b: 水煮法：沉淀物加100μl蒸馏水，摇均水煮20 min，离心5000 r/ min×5min收集上清。c: 1%Triton X-100裂解法：取采集的标本液100μl，加入1μl Triton X-100，水煮20 min，5000 r/ min×5min，收集上清。d: 5%NP-40裂解法：取采集的标本液100μl，加5μl NP-40，水煮20 min ，5000 r/ min×5min收集上清。e: 如标本溶血严重经上述裂解处理后，再加等体积酚-氯仿抽提、冷沉淀DNA，加10μl DW溶解待检。

　　2、PCR扩增

　　(1)引物设计。以HSV DNA聚合酶的高保守区为检测靶序列以确保特异性。设计3个引物，一个上游共同性引物，DNAP5(5′ATGGTGAAAACATCGACATGTACGG3′)：二个下游特异性引物，DNAP3-1(5′CCTCGCGTTCGTCCTCGTCCTCC3′　)和DNAP3-2(5′CCTCCTTGTCGAGGCCCCGAAAC3′)，可以分别扩增出HSV-1 469bp DNA片段(1981～2359)、HSV-2 391bp片段(1561～1953)：从二型PCR扩增产物中设计了一个不分型的特异性探针HSVP3 5 'GGCGTAGTAGGCGGGGATGTCGCG 3‘)。

　　(2)PCR实验体系。取模板10μl： DNAP5 0.5(0.2μmol/L)：DNAP3-1 0.5μl (0.2μmol/L)：DNAP3-2 0.5μl (0.2μmol/L)：4×dNTP 8μl(4×200μmol/L)：10×dNTP 8μl(4×200μmol/L);10×缓冲液10μl：DMSO 4μl;加DW 65.5μl; 油 30μl.。

　　水煮(96℃～100℃

　　加TaqDNA聚合酶1μ

　　72℃

　　↓

　　95℃

　　↓

　　65℃60s → 72℃

　　↓　　33个循环

　　70℃

　　3.扩增产物的检测和分析

　　(1)糖凝电泳染色法：取扩增产物20μl加样品缓冲液4μl混匀后，点样于2%琼脂糖凝胶板，70V电泳15～20min，溴化乙(EB)染色5min，于紫外灯下观察结果在溴酚蓝后面有一条或二条亮红带为阳性结果，HSV-2带在前，HSV-1带在后，无带则为阴性结果。

　　(2)XhoI酶谱法：取HSV-1型PCR产物50μl加XhoI50U，37℃1h后，置3%琼脂糖凝胶中，70V电泳15～20min，可产生46bp片段带(引物后面);与正常PCR产物比较，XhoI酶切后的大片段电泳位置前移。

　　(3)Southern印迹法：PCR产物20μl经电泳分离后，用变性液处理60min，再用中和液处理90 min，转移至硝酸纤维素膜上：80℃烤膜2 h，42℃预杂交(杂交液中)30 min， 加入32p标记HSVP3探针后，42℃杂交过夜;次日用1%SDS/ PBS pH7.2， 42℃洗15min， 0.5% SDS/PBS pH7.2， 42℃洗15min; 膜置X线暗盒内放射性自显影12～15h， 显影为阳性， 不显影为阴性。

　　(二)套式

　　套式PCR(nested primers-polymerase chain reaction，NP-PCR)是通过“外侧”、“内侧”两对引物，即一对扩增较大DNA片段的“外侧”引物和一对位于扩增产物中再扩增小片段的“内侧”引物，这样两次连续放大可以提高PCR检测的灵敏度，保证产物的特异性。但该方法不能分型，能100%检出HSV-1，50%检出HSV-2，应改进分型检测HSV，更好地在临床应用和基础研究中推广应用。

　　1、标本处理：

　　(1)标本采集同上

　　(2)DNA 制备：①脑脊液：取100μlCSF 水煮15min，加入250μl无水乙醇，放-30℃10 min;离心10000g30 min，去上清，30℃干燥后，加入10μl DW; ②脑组织细胞：取沉淀物加100μl蛋白酶K消化裂解液，56℃作用1h，水煮10 min;取上清加入等体积酚一氯仿(V/V)，轻摇10 min，离心10000r/ min×10 min;取水相，加入250μl DW溶解。

　　2、PCR扩增

　　(1)引物设计：选择HSV1糖蛋白D基因为检测靶基因。

　　NP-PCR 的引物和探针序列

　　“外”引物

　　“内引物”

　　探针

　　(2) PCR实验体系和程序： 反应体积为50μl;模板10μl;BJHSV1.1 0.5μl(0.2pmol/L); BJHSV1.2 0.5μl(0.2pmol/L); 10×缓冲液5μl; 4×dNTP 4μl(4×200mmol/L);DW 27μl; 石蜡油30μl。循环参数为95℃30s; 55℃30s; 72℃60s; 循环20次， 取其扩增产物1μl加入含有BJHSV1.3和BJHSV1.4反应体系中进行套式扩增， 先95℃变性2min，循环参数为95℃30s; 55℃30s; 72℃60s; 循环30次后，72℃延伸5 min;。

　　(3) 扩增产物分析：

　　① 琼脂糖凝胶电泳染色法：

　　取扩增产物10μl点样于2%琼脂糖凝胶中， 70V电泳15-20min，溴化乙锭染色5min，于紫外灯下观察结果，在溴酚兰后面有一条，或二条亮红条带为阳性结果， HSV-2带在前，HSV-1带在后，无带则为阴性结果。

　　② Southern印迹法：

　　PCR产物20μl 经电泳分离后，用变性液处理60min，再用中和液处理90min，转移至硝酸纤维素膜上，80℃烤膜2h，42℃预杂交(杂交液中)30min，加入32P标记HSV探针后，42℃杂交过夜，次日用1%SDS/PBS pH7。2，42℃洗15min，0.5%SDS/PBS pH7.2，42℃洗15min;膜置X线暗盒内，放射性自显影12-15h，显影为阳性，不显影为阴性。

　　(三)、聚合酶链反应—酶谱法

　　具有经济广泛等特点;不仅能一次性分型检测HSV-1，HSV-2，EBV，CMV四种病毒，而且方法本身快速、方便、无放射线损伤，易被实验室接受。可检出3个CFU的HSV1，灵敏度高，能检测出中枢感染第1dCSF中HSV DNA阳性结果，并可用于治疗效果的评价。由于病毒的变异性，会出现酶切点突变丢失现象，从而造成酶切阴性结果。对此可以通过型特异性探针或序列分析解决。

　　1. 标本处理

　　(1)标本采集，方法同上。

　　(2)DNA模板制备：每份标本取200μl，按200μg/ml加入蛋白酶k，56℃作用

　　加入等体积的酚—氯仿(v/v)轻摇10min，离心1000r/min×5min;取水相加入500μl(2.5倍体积)无水乙醇，-20℃过夜沉淀DNA，离心15000r/min×5min，吸去液体，30℃干燥后，加蒸馏水25μl溶解， 待检。

　　2. 引物设计：

　　P1，5′CGACTTTGCCAGCCTGTACC3′

　　P2，5′AGTCCGTGTCCCCGTAGATG3′

　　(1)PCR实验体系：

　　反应体积100μl; 模板10μl ; P1 0.5μl(10pmol/L) ，P2 0.5μl(10pmol/L); 4×dNTP 4μl(4×200mmol/L); 10×缓冲液10μl， DMSD 5μl， DW 65μl， 循环参数为94℃60s; 60℃60s; 72℃60s;循环40次72℃延伸4min。

　　(2)扩增产物检测与酶切分型

　　①第一步电泳鉴定： 取10μlPCR产物加4μl样品缓冲液，加入2%琼脂糖凝胶板，70V电泳(5-20min)加EB染色5min后，紫外灯下观察，可初步鉴定扩增产物大小。

　　②酶切分析：分别取20μlPCR产物于2个Eppendorf管中，加入50μl无水乙醇，-20℃沉淀DNA，再分别用20μlSmal和BamHI反应缓冲液溶解，加入SmaI或BamHI 50U于相应Eppendorf 管内，37℃作用1h。

　　③第二步电泳分型，取10μlPCR酶切物加4μl样品缓冲液，加到2%琼脂糖凝胶中，70V电泳，15-20min后， EB染色5min，与同步加入未酶切的PCR产物相对照。 紫外灯下观察， 结果如下

　　PCR-EC法检测四种病毒结果

　　病毒型号靶片段

　　HSV2518bp—

　　CMV589bp不需酶切，第一步电泳就可以区分

　　(四)用RT-PCR检测单纯疱疹病毒

　　的聚合酶链反应(RNA-PCR)，可能通过检测HSV不同期的RNA，这不仅可诊断HSV感染，而且有利于HSV的潜伏期感染机制的深入研究。

　　RT-PCR是以RNA为模板经逆转录反应(RT)产生cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增以达到检测目的。因此，RNA-PCR也可称为RT-PCR。

　　1、标本处理：

　　组织块细胞总RNA提取，取100mg组织标本，加1ml硫氰酸胍变性液，于匀浆器中，室温研磨均匀后，移入2.5mlEppendorf 管中。依次加入0.1ml3mol/L(pH4.0)NaAc， 1ml水饱和酚和0.2ml氯仿一异戊醇混匀， 用力振摇10s， 置冰浴15min。10000g4℃，离心20min，取上清水相(上层DNA、下层DNA和变性)加入等体积异丙醇置-20℃1h， 沉淀RNA。离心 15000r/min×10min，弃上清， RNA重新用0.3ml硫氰酸胍变性液溶解， 再加0.3ml异丙醇沉淀， -20℃1h， 沉淀RNA. 离心15000r/min×10min， 去上清， 沉淀RNA用75%冷乙醇洗一次， 真空干燥。。加10μl TE缓冲液(pH7.4)溶解，低温保存备用。临用前冰浴溶解。

　　2、PCR扩增

　　(1)引物设计： 选择HSV-1ICPO基因(极早期)为检测靶基因。设计2个引物，

　　P1 5′GGATCCTCACGTGGTTACCCGCGGTCT 3′

　　P2 5′AAGCTTCCGGGGCCGTCCCCGCGGGCG 3′可以扩增ICPO 中266bp序列。

　　1个探针：5′CCGGCTGGAGCCGCCGCACCCTGCT3′。

　　(2)PCR实验体系： 总反应体积为50μl，模板10μl (0.25-1.0μg)P1 1μl (20pmol/L);P2 1μl (20pmol/L); 4×dNTP 4μl(200μmol/L); 10×缓冲液5μl; AMV(逆转录酶) 2μl (50U); DW 26μl; 循环参数， 94℃变性2min后 94℃50s，60℃60， 72℃60s，循环40次后72℃延伸5min。

　　3、扩增产物的鉴定：

　　(1)琼脂糖凝胶电泳染色法：取10μl PCR扩增产物加4μl 样品缓冲液，混匀后加样2%琼脂糖凝胶板，70V电泳15-20min，EB染色5min。紫外灯下观察扩增条带。

　　(2)Southern印迹杂交法：用32P标记的特异性探针检测PCR产物，方法同上。

　　总之，在HSV感染性疾病的临床诊断中，PCR能对前病毒或潜伏期低复制的HSV特异性靶DNA片段进行扩增检测，远较DNA探针敏感，并能在血清中抗体出现前就可以检出。因此，PCR无论是作为基础研究手段，还是作为临床检验诊断方法，均具有广阔的前景。

　　五、病理组织学诊断

　　细胞内，基底层形成大水疱，病灶周围有多核巨细胞浸润，特别是多核白细胞与细胞充斥于病灶中间。

　　1.原发性

　　(1)潜伏期：为2～7天，常为3～5天。

　　(2)好发部位：男性多发生于龟头、冠状沟、尿道口、阴茎体及阴囊。女性好发于外阴、阴道及宫颈。两性均可见于肛周、大腿及臀部。

　　(3)皮损形态及演变：患处先有烧灼感，随即出现多个群集的红色，并迅速变成小水疱。疱液起初清亮，以后渐变为脓性。水疱易破溃，形成糜烂或浅，伴明显疼痛。之后而愈，病程约2～4周。

　　(4)全身症状：发病前或发病时可有全身症状，如、、全身不适、颈项强直和骶2～4段感觉异常，或有排尿困难和。几乎所有患者均可伴腹股沟及压痛。

　　2.复发性

　　约在原发性GH痊愈后1～4个月发生。首次HSV-2感染后1年内近60%的患者复发，第1年内可复发4～6次，以后复发次数减少。eves等发现在生殖器感染者中，HSV-1感染者复发率为14%，而HSV-2感染者则有60%复发。

　　复发性GH患者可有上述激发因素，或有前驱症状，全身症状较轻，复发部位多在原处，病程也较短，皮损约经10天左右即消退。由于病损反复发作，难以控制，患者易出现精神负担和性功能障碍，甚至发生等。但其损害与原发性者甚为相似。

　　3.特殊型

　　(1)男性同性恋者GH：本病仅次于淋球菌引起的肛门直肠炎。有人从62例有肛门直肠症状但淋球菌检查阴性的男性同性恋者中，29%检出了HSV-2。临床表现多为严重的肛门、，其他症状为、肛门内有分泌物、里急后重和发热等。部分病人肛周有水疱或溃疡。

　　(2)孕妇和新生儿GH：孕妇患GH后，其后果严重。对GH患者HSV-2携带者来说，最重要的是传染给新生儿。当内存在HSV-2时，可有40%～60%的新生儿遭受感染，感染严重者可致死亡。

　　在妊娠早期，患GH的孕妇可影响胎儿，导致或。新生儿的先天性感染，出生时可出现带状分布的疱疹、发作、与。如通过产道感染或而发生逆行感染时，轻者出生后数日至数周可无临床症状，早期可仅有吃奶较差、兴奋，以后可发生病或疱疹性脑炎，重者发生播性HSV感染，可出现、、出血及中枢神经系统病变，预后不良。

　　因此，妊娠足月患GH者，如时间允许，应每周从阴道及颈取材，检查有无病毒感染，若细胞学或病毒培养阳性而羊膜尚完整，或破裂后不足6h，建议剖宫产，以避免胎儿经阴道而发生新生儿HSV感染。

　　HSV-2感染与：有证据表明，生殖器HSV-2感染可能与宫颈癌的发生有关。血清流行病学检查发现，宫颈癌患者血清中抗HSV-2抗体较对照组妇女明显增高。Nahmias等发现，GH患者发生宫颈型者为对照组的2倍，而发生原位癌者则为对照组的8倍。近年来研究证明，患侵袭性宫颈癌和癌前期病变的妇女宫颈落细胞中，HSV-2抗原阳性率明显高于对照组，这种HSV-2抗原位于的胞质内，提示为肿瘤细胞表达的病毒抗原。有人发现，宫颈有高度非典型增生、原位癌及者的活检组织中，用间接免疫荧光染色可发现其中的HSV-2抗原。应用DNA-RNA原位杂交技术在宫颈癌和癌前期组织中67%可发现HSV-2特异性mRNA。Frenkel等在宫颈癌组织中检出HSV-2的DNA。还有作者从切除后经放射的宫颈癌病变组织中分离出了HSV-2。

　　HSV-2感染与 与其他生殖器溃疡性疾病一样，GH增加了HIV感染的危险性。HSV感染是HIV感染的辅助因子。在HIV感染者尤其是HIV感染的同性恋者中，HSV-2感染率更高，且GH的并发症多而严重。在AIDS患者中，耐(无环鸟苷)的HSV毒株感染多见。

　　根据病史、症状和皮肤或黏膜表现，一般不难作出诊断。必要时可进行实验室检查，以明确病原体。

（实习编辑：张曼）